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단일 분자로도 측정 가능한 고효율 신약발굴 센서 개발
연구책임자 : 지승욱/이미경
작성일 : 2023-04-14
조회수 : 295

단일 분자로도 측정 가능한 고효율 신약발굴 센서 개발
- 신약개발의 시간과 비용을 크게 줄여줄 극미량/초고감도 신약 스크리닝용 나노포어 센서 개발
- 기존 약물 탐색이 어려웠던 표적들에 대한 신약개발 가능성 제시

□ 국내 연구진이 신약개발에 드는 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있는 신약발굴 센서를 개발하였습니다.

□ 한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 바이오의약연구부 지승욱 박사 연구팀은 단일 분자 수준에서 극미량, 초고감도로 측정 가능한 고효율 신약발굴용 나노포어(nanopore) 센서를 세계 최초로 개발하였다고 밝혔습니다.

 ㅇ 이를 통해 신약개발의 효율성을 높이고, 그동안 후보물질 탐색이 어려웠던 질환 표적들에 대한 새로운 신약개발 접근법을 제시할 수 있을 것으로 기대되고 있습니다. 

□ 신약개발의 첫 단추인 후보물질 발굴은 표적 질환 단백질과 약물 간 결합을 분석하는 것이 관건이나 기존 분석기술의 낮은 효율성으로 인해 후보물질 발굴에 요구되는 많은 비용과 시간으로 어려움을 겪고 있습니다.

 ㅇ 현재까지 개발된 분석기술은 고가의 장비가 필요하거나 여러 분자를 조합(ensemble) 단위로 측정한 신호를 평균 내는 방식으로 민감도가 낮고 많은 양의 시료가 필요하며, 일부 표적 단백질과 약물은 시료의 용해도가 낮아 신약개발에 접근하기가 매우 어려운 실정입니다. 

□ 나노포어 센서란 수 나노미터(㎚, 10억분의 1m) 크기의 구멍을 통한 이온의 흐름을 전기적으로 측정하는 센서 시스템으로, 생체분자가 나노포어 내부를 통과할 때 발생하는 전기신호를 측정하여 단일 분자의 특성을 분석할 수 있습니다. 

 ㅇ 하지만 기존의 나노포어 센서는 크기나 전하가 다양한 단백질을 측정하기 어려우며, 단백질의 약물 결합 여부를 구분하기에는 민감도의 한계가 있었습니다. 

□ 이에 연구팀은 단일 분자(single molecule) 수준에서도 표적 단백질-약물 결합을 분석할 수 있는 고효율 신약발굴용 나노포어 센서를 개발하였습니다.

 ㅇ 연구팀은 단백질 엔지니어링 기술을 이용해 나노미터 크기인 구멍으로 1개의 표적 단백질만 포집할 수 있도록 깔때기 구조로 디자인하였고,

 ㅇ 전기삼투(electro-osmosis) 현상을 활용해 다양한 표적 단백질을 한 번에 한 개씩 개별적으로 측정할 수 있어 피코몰(picomole, 1조분의 1 mole) 수준의 극미량의 시료만으로도 초고감도로 약물 스크리닝이 가능합니다. 

□ 이를 통해 기존 약물 스크리닝 기술인 핵자기공명분광법(NMR)과 비교해 시료량을 약 4500배 절감할 수 있어 매우 경제적이며, 표적 단백질과 약물 시료 준비에 드는 시간과 비용을 현저히 절감해줄 수 있습니다. 

 ㅇ 이뿐만 아니라 동일한 표적 단백질에 결합된 서로 다른 저분자 약물들을 민감하게 구분할 수 있는 약물 지문(drug fingerprinting) 기술을 개발하여 효율적인 약효 분석과 약물의 작용 메커니즘을 정확하게 규명할 수 있도록 하였습니다.

□ 특히 이번에 개발한 센서는 단일 분자에서 단백질-단백질 상호작용과 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 약물의 약효 분석도 가능합니다.

 ㅇ 이를 통해 단백질-단백질 상호작용 표적을 비롯해 그동안 신약개발이 어려웠던 표적들과 낮은 용해도의 난용성 표적들(insoluble targets)에 대해서도 새로운 신약개발 접근의 가능성을 제시하였습니다.

□ 연구책임자인 지승욱 박사는 “단일 분자로도 표적 단백질-약물 결합을 측정할 수 있는 초고감도의 새로운 나노포어 센서 개발에 성공하여 극미량 시료만으로도 고효율 신약발굴이 가능해질 것이다.”라며, 

 ㅇ “향후 신약발굴에 소요되는 시간과 비용을 감소시켜 신약개발의 효율성을 높이고, 단백질-단백질 상호작용과 난용성 표적 등 그동안 신약개발이 어려웠던 표적들에 대해서도 신약개발 가능성이 기대된다.”라고 밝혔습니다.

□ 한편 이번 연구성과는 4월 4일 세계적인 과학저널인 Nature Communications(IF 17.694) 온라인 판에 게재되었으며,
    (논문명 : Single-molecule fingerprinting of protein-drug interaction using a funneled biological nanopore / 교신저자 : 지승욱‧이미경 박사 / 제1저자 : 정기백‧김진식 박사, 류민주 UST KRIBB스쿨 박사과정)

 ㅇ 생명연 주요사업, 과기정통부 개인기초연구사업 중견연구, 바이오‧의료기술개발사업, NST 융합연구단 사업의 지원으로 수행되었습니다. 

 
<그림 설명>



그림1. 단일 분자 수준으로 표적 단백질-약물 결합 측정 가능한 새로운 나노포어 센서 개발 

  단일 분자 수준에서 표적 단백질-약물 결합 측정이 가능한 고효율 신약발굴용 나노포어 센서 개발



그림2. 신규 나노포어 센서 단백질의 삼차 구조 및 나노유체 특성

  강력한 전기삼투(electroosmotic flow) 현상을 발생시키는 나노포어 단백질 센서의 나노유체학적 특성을 연구
  a. 나노포어 단백질의 깔때기 구조 및 표면특성
  b. 나노포어 단백질의 커피 드리퍼(coffee dripper) 모양의  구조
  c. 나노포어 단백질의 표면전하 밀도 분석도
  d. 나노포어를 통과하는 물 분자의 유량 시뮬레이션 분석도



그림 3. 나노포어 센서를 이용한 단일 분자 표적 단백질의 분석

  입구가 넓은 깔때기와 유사한 나노포어 단백질의 구조와 나노포어 내 강력한 전기삼투 현상에 의해 다양한 크기(12.3 kDa–77.1 kDa) 및
  표면전하(pI 5.3 - 9.6)의 단일 분자 단백질들을 포집하여 전기신호를 관찰하였음.
  이는 나노포어 내부에서 표적 단백질이 에너지 최소점(energy minima) 간을 이동하며 발생하는 전류차단 변화에 따라 유도된  고유의 전기신호 패턴임.
  a. 나노포어 센서에서 단일분자 단백질의 전류패턴 유발 단계 (포획, 포집, 이탈)
  b. 나노포어 센서로 측정한 단일 분자 단백질의 고유한 전류패턴
  c. 나노포어 내 단백질 위치 시뮬레이션
  d. 나노포어 내 단백질 위치에 따른 자유에너지 변동 
  e. Holo-transferrin (77.1 kDa, pI 6.8) 단백질의 전압별 전류패턴
  f. Bcl-xL (20.8 kDa, pI 5.3) 단백질의 전압별 전류패턴
  g. FKBP12 (13.0 kDa, pI 8.0) 단백질의 전압별 전류패턴
  h. MDM2 (12.3 kDa, pI 9.6) 단백질의 전압별 전류패턴



그림 4. 나노포어 센서를 이용한 노이즈 신호 기반 표적 단백질-리간드 결합 분석

  표적 단백질 Bcl-xL에 펩타이드(Bak-BH3)와 저분자 약물(ABT-737)을 각각 반응시켰을 때 기존의 Bcl-xL 유래 전류패턴이 현저히 변하는 것을 확인하였음.
  이를 통해 나노포어 센서를 이용해 단일 분자 표적 단백질에 펩타이드 및 저분자 약물이 결합하는 것을 분명하게 검출할 수 있었음.
  나아가 일련의 전류패턴 필터링 방법을 통해 리간드 결합신호를 펩타이드의 경우 4.8 배, 저분자 약물의 경우 1.7 배 향상할 수 있었음.
  a. Bcl-xL, Bcl-xL+Bak-BH3(펩타이드), Bcl-xL+ABT-737(저분자 약물) 유래 전류패턴
  b. 주파수 필터링 조건에 따른 각 검체의 전류패턴 분석



그림 5. 나노포어 센서를 이용한 표적 단백질-저분자 약물 결합 분석

  표적 단백질에 음성대조군을 반응시켰을 때는 전류패턴의 변화가 없었던 반면, 표적 약물의 경우 현저한 전류패턴의 변화가 관찰되었으며,
  나아가 표적 단백질을 약물 혼합액과 반응시켰을 때에도 각각의 표적 약물들의 결합을 구분해 낼 수 있었음.
  이를 통해 본 연구진이 개발한 나노포어 센서는 동일한 표적 단백질에 결합하는 다양한 저분자 약물들을 민감하게 구분해낼 수 있었고,
  이는 표적 단백질-약물 결합 분석에 있어 ‘단일 분자 지문(single-molecule fingerprinting)’의 개념을 최초로 증명하였음.
  a. 음성대조군(LCL-161, GDC-0152) 및 표적 약물(ABT-737, A-1331852)을 Bcl-xL에 독립적으로 반응시켰을 때 Bcl-xL의 전류패턴 결과
  b. Bcl-xL과 약물들을 독립적으로 반응시킨 후 측정한 전류패턴을 2D 밀도(전류 vs. 노이즈) 분석한 결과



그림 6. 나노포어 센서를 이용한 Bcl-xL 표적 단백질에 대한 약물의 경쟁적 결합 분석

  표적 단백질에 펩타이드가 결합된 상태에서, 새로 첨가한 저분자 약물이 기존의 펩타이드를 해리시키고 경쟁적으로 결합되는 현상을 확인하였음.
  이를 통해, 단일 분자 수준에서 약물의 ‘구조-활성 관계 분석(SAR-by-nanopore)‘의 가능성을 확인하고, 약물의 표적 단백질 결합 부위 발굴도 가능함을 보여주었음.
  a. Bcl-xL에 대한 저분자 약물 간 경쟁적 결합 모식도
  b. Bcl-xL+Bak-BK3(펩타이드)에 저분자 약물(ABT-737) 첨가 시 전류패턴 변화 
  c. ABT-737 첨가 후 시간에 따른 2D 밀도(전류 vs. 노이즈) 분석 
  d. Bcl-xL+저분자 약물(ABT-737)에 저분자 약물(A-1331852) 첨가 시 전류패턴 변화 
  e. A-1331852 첨가 후 시간에 따른 2D 밀도(전류 vs. 노이즈)  분석